El lugar donde se encuentra la Catacumba de San Sebastián fue en la antigüedad una profunda depresión, utilizada como cantera de puzolana y llamada ad catacumbas (o «cerca de las cavidades»), un nombre que se ha convertido en sinónimo de cementerio subterráneo.

Desde el siglo I, el sitio ha sido explotado y construido intensamente: las galerías subterráneas se reutilizaron para obtener nichos funerarios; en la superficie, sin embargo, se construyeron varios columbarios y al menos dos sistemas residenciales (la llamada villa pequeña y villa grande) equipados con notables decoraciones pictóricas en las paredes.

Hacia mediados del siglo II, se enterró el fondo del valle para crear un terreno de juego, en un lado del cual se construyeron tres mausoleos sucesivamente (por Clodio Hermes, por los Inocentiores, por el Hacha).

Se hizo un nuevo entierro de la zona para dar espacio a la construcción de la triclia, un pórtico bordeado por una pared en el que se hacían numerosas invocaciones de grafitis dirigidas a las SS. Pedro y Pablo, que fueron venerados juntos en este lugar alrededor de 250.

En el sitio, entonces, el emperador Constantino ((306-337) tenía una basílica en forma de circo romano (llamada «circiforme»).

Mientras tanto, ya en el siglo III, la catacumba que albergaba las tumbas de los mártires Sebastián y Eutichio comenzó a desarrollarse bajo tierra.